疎水性カラムクロマトグラフィー

疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）は、主にタンパク質、特に疎水性特性を持つタンパク質の分離と精製で利用される強力な手法です。このクロマトグラフィー法は、サンプル分子と固定相の間の微分疎水性相互作用を活用し、移動相での溶出中の移動速度に基づいて成分の分離を可能にします。この包括的な記事では、疎水性相互作用クロマトグラフィーの原則、操作、アプリケーション、利点、欠点、最近の進歩を掘り下げます。

 

HICの基礎は、タンパク質分子と固定相に付着した疎水性リガンドとの間の疎水性相互作用にあります。本質的に両親媒性であるタンパク質には、疎水性残基と疎水性残基の両方が含まれています。水溶液では、親水性残基は外側に向かい、水分子と相互作用する傾向がありますが、疎水性残基はしばしばタンパク質の三次構造内に埋葬されます。しかし、高塩濃度の存在などの特定の条件下では、これらの疎水性残基が露出する可能性があり、クロマトグラフィーマトリックス上の疎水性リガンドとの相互作用を促進します。

HICの移動相は、通常、6-8のpH範囲を持つ緩衝生理食塩水溶液で構成されています。高塩濃度が疎水性相互作用を促進するために使用され、タンパク質の定常相への結合を促進します。溶出中の移動相における塩濃度の徐々に減少すると、洗浄力が増加し、タンパク質が疎水性に基づいて溶出することができます。疎水性相互作用が弱いタンパク質が最初に溶出され、その後、より強い相互作用があるタンパク質が溶出されます。

 

溶出されたタンパク質の分離効率と純度に直接影響するため、HICではクロマトグラフィーマトリックスの選択が重要です。マトリックスは、逆相クロマトグラフィーでしばしば観察されるタンパク質の変性と不可逆的な吸着を避けるために、弱い疎水性リガンドで設計されています。一般的なマトリックスには、アガロース、ポリアクリルアミド、およびフェニル、ブチル、プロピルリガンドなどの疎水性基で修飾されたシリカベースのゲルが含まれます。 移動相組成は、HICで極めて重要な役割を果たします。硫酸アンモニウム（（NH4）2SO4）や塩化ナトリウム（NaCl）などの高塩濃度を使用して、疎水性相互作用を促進します。バッファーのpHは、タンパク質の安定性を維持し、固定相への結合を最適化するために慎重に調整されます。通常、0。0 1から0.05 mol/Lの範囲のバッファーの濃度も、分離プロセスに影響します。

HICの運用手順には、クロマトグラフィーカラムのサンプル調製、荷重、溶出、再生など、いくつかの重要なステップが含まれます。 ◆サンプル準備：荷重の前に、通常、サンプルは、移動相Aの塩濃度とpH（平衡バッファー）に一致するように調整されます。これにより、最適な結合条件が保証され、サンプル希釈が最小限に抑えられます。 ◆ロード：サンプルはカラムに適用されます。カラムでは、タンパク質が疎水性に基づいて固定相と相互作用します。 ◆溶出：溶出は、移動相の塩濃度を徐々に減少させることで達成され、疎水性相互作用が弱まり、疎水性の増加順にタンパク質を溶出させることができます。 ◆再生：使用後、カラムは蒸留水または適切な洗浄剤で洗浄して、しっかりと結合した汚染物質を除去し、後続の実行のためにカラムを準備することにより再生されます。

疎水性カラムクロマトグラフィーの方法論には、サンプルの準備、柱の平衡化、サンプルのロード、溶出、分数の収集など、いくつかの重要な手順が含まれます。

◆サンプル準備:
サンプルをカラムにロードする前に、移動相A（平衡バッファー）の塩濃度に合わせて十分な塩を追加することにより、サンプルを準備することが重要です。サンプル溶液のpHは、吸着条件を満たすように調整する必要があります。

◆列の平衡化:
カラムは、特定のpHおよび塩濃度の緩衝生理食塩水である移動相Aで平衡化されています。これにより、固定相がバッファーで飽和し、サンプルタンパク質と相互作用する準備ができていることが保証されます。

◆サンプルのロード:
準備されたサンプルは列にロードされます。サンプルの体積は、メディアの成分濃度と結合能力の影響を受けます。希釈サンプルの場合、事前の濃度なしで直接負荷が可能です。

◆溶出:
溶出は、移動相の塩濃度を徐々に減少させることで達成され、それによりタンパク質と固定相の間の疎水性相互作用が弱まります。あるいは、有機溶媒または洗剤を移動相に追加して極性を変化させるか、結合したタンパク質を変位させることにより、溶出を達成できます。

◆画分のコレクション:
溶出された画分を収集および分析して、標的タンパク質の純度と回復を評価します。

 

いくつかの要因は、疎水性カラムクロマトグラフィーのタンパク質の分離効率と純度に大きく影響します。

◆塩濃度とタイプ:
移動相中の塩の種類と濃度は、疎水性相互作用の調節において極めて重要な役割を果たします。硫酸アンモニウムや塩化ナトリウムなどの塩は一般的に使用され、濃度は0。硫酸アンモニウムでは75〜2 mol/L、塩化ナトリウムでは1〜4 mol/Lの濃度があります。

◆ph:
移動相のpHは、タンパク質の電荷状態と疎水性に影響します。タンパク質の等電点からのpHは、疎水性相互作用を減らすことにより溶出を好む傾向があります。

◆温度:
カラム温度を上げると、疎水性相互作用が向上し、分離効率が向上します。

◆流量:
流量は、カラムのタンパク質の滞留時間に影響を及ぼし、静止相との相互作用に影響します。

◆列の特性:
カラムの長さ、直径、および梱包材はすべて分離効率に寄与します。固定相材料とその表面特性の選択も重要です。

 

HICは、血清タンパク質、膜結合タンパク質、核タンパク質、受容体、組換えタンパク質など、さまざまなタンパク質の精製に広範な応用を発見しています。その穏やかな分離条件により、酵素、抗体、その他の治療タンパク質などの活性物質の精製に特に適しています。

◆タンパク質精製：HICは、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティクロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー方法に従って、高い純度レベルを達成するための他のクロマトグラフィー方法に従って、研磨ステップとしてよく使用されます。 ◆抗体精製：モノクローナル抗体およびその他の免疫グロブリンは、HICを使用して効果的に精製し、治療および診断用途での使用を促進できます。 ◆タンパク質バリアントの分離：HICは、バイオ医薬品の特性評価と品質制御を支援する、タンパク質アイソフォーム、活性および非アクティブな形態、および切り捨てられた種を区別できます。

利点:

1）高い回復率：HICはタンパク質の高い回復率を提供し、大規模な精製プロセスに効率的にします。

2）維持されたタンパク質活性：軽度の分離条件は、タンパク質の変性と活性の喪失を最小限に抑えます。

3）汎用性：HICは、さまざまな疎水性特性を持つ広範囲のタンパク質の精製に適合させることができます。

 

短所:

1）溶解度が限られている：一部のタンパク質は、高塩濃度で溶解度の低下を示す可能性があり、HICへの適用性を制限します。

2）塩干渉：移動相の高塩濃度は、その後の分析手順を妨げる可能性があり、追加の脱塩手順が必要です。

 

HICの最近の進歩は、分離効率と安定性が向上した新しいクロマトグラフィーマトリックスの開発に焦点を当てています。親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）の原理と混合モード樹脂の使用の組み込みにより、HICの適用性が極性化合物の分離に拡大しました。

さらに、HICのイオン交換クロマトグラフィーやサイズ排除クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー技術との統合により、より効率的で堅牢な精製プロトコルの開発が促進されました。自動化およびハイスループットスクリーニング技術の進歩は、HICプロセスのスケーラビリティと再現性にも貢献しています。

HIC研究の将来の方向には、分離効率をさらに改善し、アプリケーションの範囲を広げるための代替リガンドとマトリックスの調査が含まれます。より環境に優しい、持続可能な携帯電話の段階の開発、およびタンパク質の変性を最小限に抑えるための溶出条件の最適化は、進行中の研究の領域のままです。

結論として、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、タンパク質、特に疎水性特性を持つものの分離と精製のための多用途で効果的なツールを表しています。サンプル分子と固定相の間の微分疎水性相互作用を活用することにより、HICは、さまざまな治療、診断、および研究用途向けの高品質タンパク質の精製を可能にします。クロマトグラフィー材料、自動化、および他の技術との統合の進行中の進歩により、HICの未来は、バイオ医薬品の分野でさらに効率とより広範な適用性を約束します。

 

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